膜蛋白的研究对于了解细胞的生物学功能和设计药物的靶位点有着十分重要的意义，然而膜蛋白由于其天然含量低、疏水性强、分离纯化困难和克隆表达技术不完善等因素使其研究进展缓慢。本文通过将膜蛋白基因与多角体（polh）基因融合进行表达，从而达到提高膜蛋白的表达量，并利用多角体蛋白溶解特性进行简便快速纯化。通过筛选家蚕cDNA文库，获得一条线粒体内膜转运蛋白的基因，进行生物学信息分析发现其包含一个TIM17结构域，将其命名为BmTIM17。将polh基因与tim17基因融合插入表达载体pET-28a(+)中，并在两基因中引入凝血酶（Thrombin）酶切位点核酸序列，成功构建pET-28a(+)-polh-thr-tim17,同时构建表达载体pET-28a(+)-tim17做为对照。经1mM IPTG诱导，没有融合polh基因的tim17基因没有表达，而融合polh基因的tim17基因高效表达，表达量达到总蛋白的35%。利用多角体蛋白的溶解特性通过调节溶液pH和差速离心进行简便纯化，纯化的融合蛋白的纯度可达到93%，进行Western blot和质谱（MS）分析确定表达的为Polh-Thr-TIM17蛋白；融合蛋白经凝血酶酶切和凝胶过滤层析去除多角体蛋白，得到纯化的TIM17蛋白。同时利用家蚕杆状病毒表达载体系统构建了重组杆状病毒vBm-tim17和vBmpolh-tim17，并在家蚕细胞中进行表达，Western blot鉴定和荧光定量PCR结果表明融合polh基因的tim17基因在家蚕细胞中成功表达，没有融合polh基因的tim17基因没有检测到表达，再次证明polh基因能有效促进外源基因的表达；polh基因和膜蛋白基因的融合，极大的促进了膜蛋白的表达量，简化了膜蛋白的纯化过程，为对膜蛋白结构和功能的研究奠定基础。

>>查看原文初稿链接<<

>>更多科技论文<<