家蚕贮藏蛋白2 (Storage Protein 2, SP2)不仅是家蚕生长发育过程中重要的能源物质,而且还具有抑制细胞凋亡的活性。本研究从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中克隆了sp2基因(GenBank登录号:DQ443358),构建重组质粒pET-28a(+)-sp2,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达融合蛋白,镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰雄兔获得多克隆抗体。用Western blot方法检测了SP2在家蚕各发育时期和五龄幼虫各组织中的分布情况,结果发现,SP2在蛹期和五龄幼虫的血淋巴中含量较高,而在卵及蛾期没有检测到该蛋白。通过亚细胞定位发现,该蛋白主要存在于细胞膜和细胞质中。同时利用Bac-to-Bac系统构建了含有sp2基因的重组杆状病毒表达载体,在家蚕BmN细胞中大量表达带有6×His标签的融合蛋白并纯化,将纯化的SP2作用于星孢菌素诱导凋亡的人脐静脉血管内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC),MTT检测结果表明,SP2能明显增强HUVEC的活力;进一步利用ELISA法检测DNA片段化程度并利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,结果均表明SP2对星孢菌素诱导的HUVEC凋亡具有一定的抑制作用。
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